Produción e caracterización bioquímica da lacasa NRC 620 de cogomelo ostra e avaliación da súa eficacia na clarificación do zume de mazá.

Tras 25 días de incubación estática a 28 °C, a lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC620 mostrou a maior actividade no medio de cultivo fúnxico. Os valores óptimos de pH e temperatura para este encima foron 3,0 e 70 °C, respectivamente. Tras 2 horas de incubación a 40 °C e 50 °C, a actividade encimática mantívose no 68,33 % e no 59,61 %, respectivamente. Tras 2 horas de incubación en tampón citrato-fosfato (pH 7,0), a actividade encimática mantívose no 100 %. A adición de 10 mM de MgSO₄ e CuSO₄ aumentou a actividade encimática aproximadamente nun 21 % e un 35 %, respectivamente, mentres que NaCl, MnCl₂, KCl e CaCl₂ inhibiron a actividade encimática. Usando ABTS como substrato, os parámetros cinéticos (Km e Vmax) da lacasa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 foron de 1,99 mM e 16.217 μmol min−1 L−1, respectivamente. O tratamento encimático das mostras de zume de mazá reduciu significativamente tanto o pH como a viscosidade, e esta redución correlacionouse cun aumento do tempo de almacenamento. O tratamento con lacasa provocou unha lixeira diminución do contido fenólico total do zume de mazá, pero non se observou ningunha redución da actividade antioxidante.
Nos últimos anos, os investigadores centráronse na aplicación da biotecnoloxía verde na industria alimentaria. A lacasa é un dos encimas máis útiles na industria alimentaria, e atopa aplicacións en áreas como o procesamento de zumes, a panadería, a estabilización do viño e a mellora das calidades organolépticas dos produtos alimenticios.¹Moitas plantas superiores e microorganismos segregan lacasa,²e fungos como os deuteromicetos, os ascomicetos e os basidiomicetos tamén poden producir lacasa.³A lacasa (EC 1.10.3.2) é unha oxidase azul que reduce o osíxeno molecular a auga mediante un sistema que consta de tres átomos de cobre diferentes, oxidando así varios compostos fenólicos e aminas aromáticas. Durante a produción de zumes de froitas e verduras, o escurecemento encimático e non encimático son cuestións críticas.⁴Dado que estas substancias afectan negativamente á cor, ao sabor e ao aroma do zume, deben eliminarse.⁵
De todas as froitas, as mazás son as máis consumidas en todo o mundo e na Unión Europea. En 2019, a produción de mazás ocupou o terceiro lugar a nivel mundial, superando os 87 millóns de toneladas.⁶As mazás conteñen numerosos compostos fenólicos, incluíndo flavonoides e ácidos fenólicos como o ácido cafeico e o ácido cloroxénico.⁷Dado que o zume de mazá se consume normalmente na súa forma clara, pérdense aproximadamente entre o 50 % e o 90 % dos compoñentes fenólicos durante o proceso de filtración.⁸Hoxe en día, os consumidores tenden a escoller produtos minimamente procesados, como o zume de mazá turbio con alto contido en polifenois. Non obstante, debido ao seu alto contido fenólico, este tipo de zume de mazá é particularmente susceptible á decoloración e ao escurecemento.⁹Empréganse diversas tecnoloxías, incluídos métodos de tratamento térmico como a pasteurización a 60–90 °C, para reducir ou evitar o escurecemento do zume de mazá.¹⁰Porén, segundo a investigación de Sauceda-Gálvez¹¹, o procesamento térmico pode destruír os produtos químicos volátiles e afectar as calidades organolépticas do zume de mazá. As alternativas aos métodos de procesamento térmico inclúen o dióxido de carbono supercrítico, a radiación ultravioleta, os ultrasóns, a alta presión hidrostática ou a homoxeneización a alta presión.¹²A eficiencia destas tecnoloxías e o rendemento de zumes de froitas axeitados dependen dos parámetros empregados e das características do produto. O seu uso xeneralizado está limitado por custos elevados, efectos adversos na calidade dalgúns produtos alimenticios ou unha inactivación encimática inadecuada.^13,14
A lacasa pódese empregar para estabilizar e clarificar o zume de froitas.¹⁵Gökmen et al.¹⁶recomendan o uso de lacasa para a clarificación de zumes de froitas porque elimina eficazmente os compostos fenólicos converténdoos en polímeros ou oligómeros que se eliminan facilmente por calquera membrana de ultrafiltración, o que permite que o zume de mazá manteña unha cor e claridade estables durante un máximo de seis semanas a 50 °C. A lacasa purificada de *Trichoderma* inmobilizouse en esferas de alúmina e utilizouse para eliminar selectivamente os compostos de sabor desagradable causados ​​pola contaminación microbiana do zume de mazá.¹⁷
Aproximadamente o 80-90 % dos compoñentes volátiles do zume de mazá son ésteres e aldehídos, que lle confiren un aroma único.¹⁸A lacasa de *Trametes versicolor* foi inmobilizada sobre un soporte barato feito con fibra natural de cascas de coco novas para a clarificación do zume de mazá.¹⁹Estudos previos investigaron a estabilización do zume de mazá (cor e turbidez) empregando métodos sen encimas ou de inmobilización, ou en combinación con ultrafiltración.^5,19Non obstante, o efecto das lacasas fúnxicas nas propiedades fisicoquímicas do zume de mazá durante o almacenamento segue sen estar claro. Polo tanto, o obxectivo deste estudo foi investigar experimentalmente os cambios nas propiedades fisicoquímicas, o contido de compostos fenólicos e a actividade antioxidante do zume de mazá despois do tratamento con lacasas fúnxicas e un almacenamento refrixerado de dúas semanas. As lacasas teñen a capacidade de oxidar os compostos fenólicos, o que as fai prometedoras para o seu uso en varios procesos industriais, incluída a clarificación do zume. Este estudo examinou as lacasas de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, centrándose nas condicións ideais para a súa actividade e eficacia na clarificación do zume. Aínda que a investigación sobre os cogomelos ostra (P. ostreatus NRC 620) aínda é limitada, estudos previos examinaron encimas de diversas fontes fúnxicas, como Trametes versicolor e Ganoderma lucidum. O obxectivo deste estudo foi avaliar a posible aplicación deste encima na industria alimentaria e destacar as súas propiedades únicas, en particular o seu pH e temperatura ideais.
O ácido 2,2′-azooxibis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS) adquiriuse a Sigma-Aldrich (Canadá). Todos os demais reactivos eran de grao analítico.
O Centro de Recollida de Cultivos Microbianos do Centro Nacional de Investigación obtivo a cepa de cogomelo ostra coñecida NRC620. Despois do subcultivo, esta cepa almacenouse en placas de ágar con dextrosa de pataca a 4 °C. O método de preparación do inóculo foi o seguinte: inoculouse micelio totalmente desenvolvido de 10 días de idade en placas de ágar con dextrosa de pataca e incubouse a 28 °C. Despois de 10 días, retiráronse tres bloques miceliais de 12 mm de diámetro do medio de ágar cun punzón metálico estéril e colocáronse en matraces Erlenmeyer de 250 ml con tapóns de algodón que contiñan 50 ml de medio de cultivo esterilizado (pH 5,0, como se describiu previamente por Othman et al.²⁰). Os cultivos incubáronse a 28 °C durante 18 días. Despois, os cultivos filtráronse a través de papel de filtro Whatman n.º 1 e o sobrenadante resultante serviu como fonte de encimas.
A actividade da lacasa determinouse empregando ABTS como substrato. A mestura de reacción (2 mL) contiña 500 μL de ABTS 0,3 mM (disolto en tampón de citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5) e a cantidade necesaria de mostra de encima diluída con auga destilada.^21,22Tendo en conta que a lacasa pode oxidar ABTS á temperatura ambiente (28 °C ± 2), a oxidación de ABTS determinouse medindo o aumento da absorbancia a 420 nm (ε₄₂₀= 36.000 cm³^-1 M ^-1) empregando un espectrofotómetro UV Agilent Carry-100. Necesitábase unha unidade de actividade de lacasa para oxidar 1 μmol de ABTS por minuto. A concentración de proteínas determinouse mediante o método de Bradford empregando albumina sérica bovina como control interno.^23,24
Despois de obter o encima da cepa de cogomelo ostra NRC 620, a súa actividade mediuse a diferentes intervalos de cultivo durante 25 días en condicións estáticas a 28 °C.
Para estudar o efecto da temperatura na actividade da lacasa, realizáronse experimentos no rango de temperatura de 20 a 90 °C. Antes de engadir o encima e iniciar a reacción, o tampón (citrato de sodio 0,1 M, pH 4,5) e o substrato (ABTS) mesturáronse e incubáronse durante 5 minutos a varias temperaturas. A estabilidade térmica do encima avaliouse mediante incubación en tampón de fosfato de sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C durante 2 horas, respectivamente. A continuación, avaliouse a actividade residual utilizando o substrato ABTS.
O efecto do pH na actividade da lacasa avaliouse empregando ABTS como substrato en tampóns de citrato-fosfato 0,1 M cun rango de pH de 2,5 a 7,0. A solución encimática incubouse a 40 °C durante dúas horas en tampóns de citrato e Tris 0,1 M (pH 3, 4, 6 e 7) para avaliar a estabilidade do pH. A actividade residual con ABTS como substrato calculouse despois da incubación.
A lacasa incubouse durante 10 minutos en tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) que contiña varios ións metálicos (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ e Mn2+) a concentracións de 2,5 mM e 10 mM, respectivamente. A continuación, engadiuse o substrato (ABTS) para iniciar a reacción e avaliouse a actividade relativa.
A oxidación de ABTS por lacasa a varias concentracións (0,025–3 mM) mediuse a pH 4,5 para determinar os parámetros cinéticos (Vmax e Km). A cinética^constantesda ecuación de Michaelis-Menten calculáronse empregando un gráfico de Lineweaver-Burk, que representa o recíproco da velocidade de reacción en función da concentración do substrato. As constantes cinéticas calculáronse a partir do gráfico de Lineweaver-Burk empregando o software GraphPad Prism versión 6.01.
Despois de lavar ben as mazás con auga da billa, cortáronse pola metade e espreméronse cun espremedor de mazás Braun MP80 totalmente automático (fabricado en Alemaña). O zume filtrouse a través de catro capas de gasa. Non se lle engadiron encimas ao grupo de control, mentres que se lle engadiu un 2,0 % de lacasa (a concentración máis eficaz probada) ao zume de mazá acabado de preparar, que logo se almacenou a 4 °C durante dúas semanas.
A acidez titulable (AT) e o pH determináronse segundo o método de Boulton et al.^al.27O pH de cada mostra mediuse cun pH-metro dixital (pH-metro JENWAY 3510). A acidez titulable (AT) calculouse en función do ácido málico empregando a seguinte fórmula.
Onde V e C son o volume (mL) e a concentración (0,1 mol/L) da solución de hidróxido de sodio empregada na titulación, respectivamente. K é o coeficiente de conversión do ácido málico, igual a 0,067, e W é a masa (g) do zume de mazá.
Os sólidos totais solubles (^TDS) de todas as mostras de zume determinouse cun refractómetro de peto PAL-1 (ATAGO, Toquio, Xapón). Despois de cada medición, a lente óptica enxáguese con auga desionizada e cada mostra de zume de mazá analizouse tres veces. O valor de cada mostra calculouse facendo a media das tres medicións. A media ± desviación estándar para cada mostra de zume de mazá tamén se calculou facendo a media destes resultados.
A viscoelasticidade das mostras de zume de mazá avaliouse cun viscosímetro rotacional (RV, Rheotest 2, Alemaña). A mostra colocouse dentro do cilindro “S2″ do viscosímetro. A viscosidade aparente representouse pola pendente da curva de tensión de cizallamento fronte á taxa de cizallamento, que se calculou a partir da tensión de cizallamento e as curvas correspondentes a varias taxas de cizallamento (de 1,00 a 437,4 s⁻¹). A fórmula para calcular a viscosidade aparente é a seguinte:
Onde η é a viscosidade aparente (cP), τ é a tensión de cizallamento (dyn/cm²), γ é a taxa de cizallamento (seg⁻¹) e (τ) calcúlase usando os valores do par de torsión (α) e do cilindro (Z) usando a seguinte fórmula: τ = Z . α.
O índice de escurecemento determinouse segundo o método de Meidav ​​et al.^al.29Centrifugouse unha mostra de zume de 10 ml a 2750 xg durante 10 min. Mesturáronse 5 ml do sobrenadante do zume con 5 ml de etanol ao 95 %. A absorbancia da mestura mediuse a 420 nm cun espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC).
O contido fenólico total (CPT) determinouse colorimetricamente empregando o reactivo de Folin-Ciocalteu segundo o descrito por Boulton et al.^[27]. Construíuse unha curva estándar de ácido gálico para concentracións de 0 a 500 mg/L (^r²= 0,997). Os resultados exprésanse como equivalentes de ácido gálico (mg GAE/mL).
Engadir 125 μL de auga destilada e 2850 μL de solución de FRAP a 25 μL de zume de mazá e deixar a mestura na escuridade durante³⁰min. Despois, mida a absorbancia a 593 nm cun espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). O reactivo FRAP preparouse mesturando tampón acetato a 300 mM (pH 3,6), cloruro de ferro(III) a 20 mM e 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) a 10 mM (disolta en HCl a 40 mM) nunha proporción de 10:1:1. Xerouse unha curva estándar usando Trolox como estándar (^R²= 0,999) e os resultados exprésanse como μM de Trolox/mL.
A actividade antioxidante dos zumes tratados e non tratados determinouse empregando o método DPPH para avaliar a súa capacidade para eliminar os radicais libres de DPPH.³¹Dez microlitros de zume mesturáronse con 1 ml dunha solución de DPPH (100 μM) en metanol. Tras a reacción na escuridade durante 30 minutos, mediuse a absorbancia da mestura a 517 nm cun espectrofotómetro UV Shimadzu (UV-1601 PC). Os resultados expresáronse como equivalentes de trolox (μM trolox/ml) baseándose nunha curva de calibración (_^R2= 0,990).
Os datos obtidos mostraron que se observou a produción máxima de lacasa nos cogomelos ostra NRC 620 ao final do día 18 de fermentación, alcanzando unha actividade de 1302 U/L. Isto serviu como base para determinar o tempo de cultivo óptimo para a produción de lacasa (Figura 1). Aínda que a produción de encimas aumentou co aumento do tempo de cultivo, a taxa de aumento non foi directamente proporcional ao tempo de cultivo; despois de 21 días, a actividade encimática aumentara só en 90 U/L (ata 1390 U/L). Polo tanto, finalmente seleccionouse 18 días como o tempo de cultivo óptimo para equilibrar o rendemento do produto cos beneficios económicos do aumento do tempo de cultivo.
Efecto do tempo de cultivo no rendemento da lacasa en Pleurotus ostreatus NRC 620. Inoculáronse tres bloques miceliais de fungos (12 mm) en 50 ml de medio estéril e cultiváronse a 28 °C durante diferentes tempos.
En consonancia con outros estudos, os nosos resultados indican que o período de cultivo ideal para acadar o pico de secreción de lacasa por fungos probablemente sexa de entre 7 e 36 días.³²Segundo Ezike et al.³³*Trametes polyzona* WRF03 produciu a maior cantidade de lacasa ao final do noveno día de fermentación, cunha actividade específica de 1637 U/mg de proteína. Ademais, Othman et al.³⁴descubriron que *Trichoderma harzianum* S7113 segregou unha gran cantidade de lacasa no quinto día de cultivo. A taxa de produción de lacasa alcanzou un pico de actividade no décimo cuarto día e despois diminuíu gradualmente.³⁴Aínda que a secreción de encimas tamén pode ocorrer durante a fase principal de crecemento, normalmente alcanza o seu pico durante a fase intermedia e é desencadeada polo consumo dunha fonte de carbono ou nitróxeno.^34,35
Aínda que a lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620 mostrou unha alta actividade nun amplo rango de temperaturas de 50 °C a 80 °C, achegándose á actividade máxima (69–98 %), a súa actividade máxima observouse a 70 °C (Fig. 2a). Fóra deste rango de temperaturas, a actividade encimática diminuíu a aproximadamente 70 °C. Estes resultados suxiren que o encima é activo a altas temperaturas, probablemente porque a alta temperatura aumenta a enerxía cinética da reacción.
Efecto da temperatura de reacción (a) e do pH (b) na actividade da lacasa en *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Conseguíronse temperaturas que oscilaban entre 20 e 90 °C preincubando a mestura a diferentes temperaturas durante 5 minutos antes de engadir o encima e iniciar a reacción. O efecto do pH na actividade da lacasa avaliouse utilizando ABTS como substrato en solucións que contiñan tampón citrato-fosfato 0,1 M nun rango de pH de 2,5 a 7,0.
Segundo Ezike et al.^al.33, a temperatura óptima para a lacasa *Trametes polyzona* WRF03 é de 55 °C, que é a mesma que a de *Ganoderma lucidum*^lacase36e similar á temperatura óptima (50 °C) para *Trametes polyzona* KU-RNW02737^lacasa . ^Baldrian38sinala que, como ocorre con outros sistemas encimáticos que degradan a lignina, o rango de temperatura ideal para a lacasa está entre 50 e 70 °C.
Os resultados mostraron que o encima presentou a maior actividade a pH 3,0, alcanzando o 94 % de actividade a pH 3,5. Non obstante, permaneceu activo nun amplo rango de pH de 2,5 a 7,0 (Figura 2b). Ademais, presentou unha maior actividade en condicións ácidas en comparación coas condicións neutras ou alcalinas. A súa actividade mantívose polo menos no 77 % no rango de pH de 2,5 a 4,5, pero só alcanzou aproximadamente o 38 % a pH 7,0. O pH óptimo para a lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 foi de 4,533, que é o mesmo que o pH das lacasas de *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 e *Trametes hirsuta* 41. Non obstante, segundo o estudo de Chairin et al.⁴², o pH óptimo para a lacasa de *Polymorpha f. sp.* WR710-1 é 2,2, mentres que o pH óptimo para a lacasa de *Polymorpha f. sp.* IBL-04 é 5,043. A unión de anións hidróxido (inhibidor da lacasa) aos átomos de cobre da lacasa T2/T3 pode ser a razón da diminución da actividade da lacasa en condicións de pH neutro ou alcalino. Isto pode interromper a transferencia interna de electróns do centro T1 ao centro T2/T3, o que provocará^limitantea actividade encimática23,44
Ao incubar o encima a diferentes temperaturas, descubriuse que tanto o tempo de incubación como a temperatura afectaban á estabilidade do encima. En particular, a lacasa de *Trametes polyzona* NRC 620 mostrou unha maior estabilidade a 40 ℃ e 50 ℃, conservando o 68,33 % e o 59,61 % da súa actividade inicial, respectivamente, despois de 120 minutos (Figura 3a). Pola contra, nas mesmas condicións (40 ℃ e 50 ℃, 120 minutos), a lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 conservou o 64,38 % e o 42,92 % da súa actividade, respectivamente.³³Pola contra, o aumento do tempo e da temperatura de incubación reduciu a estabilidade da lacasa de *Trametes polyzona* NRC 620; despois dunha incubación a 60 ℃ e 70 ℃ durante 60 minutos, a súa actividade diminuíu ao 39,24 % e ao 1,72 %, respectivamente (Figura 3a). De acordo cos resultados experimentais, a lacasa de *Trametes polyzona* WRF03 mostrou unha maior estabilidade a 40 e 50 ℃ durante todo o proceso de tratamento térmico.³³Do mesmo xeito, Lueangjaroenkit et al.^al.37e Chairin e outros^al.42informou da estabilidade das lacasas de *Trametes polyzona* KURNW027 e *Trametes polyzona* WR710-1 a 50 °C durante 1 hora, respectivamente. Como biocatalizador útil aplicable en varios campos biotecnolóxicos, a lacasa debería ter unha boa estabilidade e rendemento nun amplo rango de temperaturas.
Estabilidade termostática (a) e estabilidade do pH (b) da lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620. A estabilidade termostática avaliouse incubando a solución encimática en tampón de fosfato de sodio 0,05 M (pH 7,0) a 40, 50, 60 e 70 °C durante 2 h, respectivamente. A estabilidade do pH avaliouse incubando a solución encimática en tampón de citrato 0,1 M e tampón Tris (pH 3, 4, 6 e 7) a 40 °C durante 2 h. A actividade residual calculouse usando ABTS como substrato despois da incubación.
Para determinar as condicións óptimas para o uso e almacenamento de encimas, investigamos o efecto do pH na estabilidade da lacasa. A exposición a diferentes valores de pH afectou significativamente a estabilidade da estrutura da proteína, influíndo así na estabilidade e actividade da molécula de encima. Os resultados mostraron que o encima era menos estable en condicións ácidas, mentres que demostrou unha mellor estabilidade a valores de pH máis altos (rexións neutras e alcalinas). A valores de pH de 7,0, 6,0, 4,0 e 3,0, as taxas de retención de encimas despois de 120 minutos foron de aproximadamente 100 %, 62,54 %, 52,39 % e 11,14 %, respectivamente (Fig. 3b). A lacasa *Strombus multisus* WRF03 mostrou unha maior estabilidade a valores de pH neutro (5,5–6,5) e unha menor estabilidade a valores de pH ácido (por debaixo de 4,0). Despois de 120 minutos a valores de pH de 5,5, 6,0 e 6,5, as taxas de retención de encimas foron de aproximadamente 82 %, 100 % e 93 %, respectivamente.³³Khairin et al.⁴²observaron que a lacasa de Trametes polyzona WR710-1 era estable no rango de pH de 6,0 a 7,0, mentres que Sayed et al.⁴⁵demostrou que a lacasa era máis estable en condicións de pH neutro. Non obstante, a lacasa de Cerrena unicolor tamén mostrou estabilidade en condicións alcalinas (pH 9,0)⁴⁶As lacasas estudadas mostraron unha alta estabilidade nun amplo rango de pH. Esta pode ser unha característica importante para aplicacións industriais.
Dado que algúns ións metálicos teñen efectos estimulantes e inhibitorios sobre a actividade encimática, os seus efectos sobre a actividade encimática deben considerarse nas aplicacións industriais. Isto é crucial porque os ións metálicos son contaminantes ambientais comúns que poden afectar a estabilidade e a síntese de encimas extracelulares.⁴⁷Para investigar os efectos de múltiples ións metálicos sobre a lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, realizamos os experimentos correspondentes. Como se mostra na Figura 4, dependendo do tipo de metal empregado, o aumento da concentración de ións metálicos de 2,5 mM a 10 mM afectou negativamente á función encimática. Por exemplo,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, e^Cu²⁺podería estimular e activar a actividade encimática, mentres que^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, e^K⁺podería inhibir a actividade encimática. A unha concentración de 10 mM, os ións Cu²⁺ e Mg²⁺ foron os activadores máis potentes da actividade lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620, proporcionando un grao de activación de aproximadamente o 34 % e o 20 %, respectivamente. Non obstante, a unha concentración de 10 mM, os ións Ca²⁺ foron o inhibidor máis potente da lacasa, reducindo a actividade encimática nun 60 % aproximadamente.
O efecto dos ións metálicos na actividade da lacasa Pleurotus ostreatus NRC 620. A lacasa incubouse durante 10 minutos en tampón de fosfato de sodio (0,05 M, pH 7,0) que contiña varios ións metálicos en concentracións de 2,5 mM e 10 mM. A reacción iniciouse entón coa adición do substrato (ABTS), tras o cal se mediu a actividade relativa.
Os nosos resultados concordan cos doutros autores que descubriron que o Mg²⁺ e o Cu²⁺ potencian a actividade de *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ descubriron que a lacasa de *Xylaria* sp. é estimulada ata certo punto polos ións de cobre (Cu²⁺). Ademais, Foroutanfar et al.⁴⁹ e Si et al.⁵⁰ realizaron estudos similares sobre lacasas de *Paraconiothyrium variabile* e *Trametes pubescens*, respectivamente. O sitio de unión ao cobre de tipo II (T2) deste encima pode estar saturado con Cu²⁺ a unha concentración determinada, o que pode explicar a estimulación da actividade da lacasa a concentracións máis altas de Cu²⁺³⁹. Dado que as lacasas dos fungos da podremia branca son oxidases que conteñen varios átomos de cobre, os efectos dos ións de cobre na actividade da lacasa son diversos e van dende estimulantes e inhibitorios ata neutros.⁵¹ Pola contra, Zhou et al.^[52]informou de que^Cu²⁺inhibiu a actividade lacasa da térmite subterránea de Taiwán (Odontotermes formosanus). Non obstante, as lacasas de Cerena sp. HYB07^[53]e Clitocybe maxima^[54]non foron afectados polos ións de cobre.
A especificidade do substrato representouse mediante os seus parámetros cinéticos (Km e Vmax); canto maior sexa a afinidade de unión do substrato ao encima, menor será o valor de Km e maior será a especificidade do substrato.^3,21,55Os parámetros cinéticos (Km e Vmax) da lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 determináronse empregando o software GraphPad Prism 6.0 representando o diagrama de Lineweaver-Burk (Figura 5). Ao empregar ABTS como substrato, os resultados foron 1,99 mM e 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}respectivamente. Elsayed et al.²¹informou que os valores de Km para a oxidación de ABTS foron de 0,1 mM e 0,064 mM, respectivamente, o que indica unha alta afinidade das isoenzimas Lac A e Lac B por ABTS. Ademais, os valores de Vmax foron de 0,182 μmol^min⁻¹e 0,603 μmol^min⁻¹, respectivamente. O valor de Km obtido foi inferior ao de Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); ademais, o seu valor de Vmax (1429 mmol min⁻¹) tamén foi^{máis baixo}ao usar ABTS como substrato.33 Do mesmo xeito, os valores de Km das concentracións de lacasa de Lentinus squarrosulus MR13 e Trametes sp. AH28-2 foron de 0,0714 mM e 0,025 mM, respectivamente, e os valores de Vmax foron de 0,0091 mM min−1 e 0,67 mM min−1 mg−1 (en relación con ABTS)^{, respectivamente.56,57}
Investigouse o efecto da concentración de ABTS na actividade da lacasa de *Pleurotus ostreatus* NRC 620 e representouse unha gráfica de Lineweaver-Burk do recíproco da velocidade de reacción inicial fronte á concentración de ABTS. A reacción de oxidación de ABTS con diferentes concentracións (0,025–3,0 mM) de lacasa mediuse a pH 4,5 para determinar os parámetros cinéticos (Vmax e Km). As constantes cinéticas de Michaelis-Menten calculáronse usando a gráfica de Lineweaver-Burk do recíproco da velocidade de reacción fronte á concentración do substrato. As constantes cinéticas calculáronse a partir da gráfica de Lineweaver-Burk usando o software GraphPad Prism 6.01.
As encimas clarificantes tradicionais, como as pectinases, hidrolizan as substancias pécticas, reducindo a viscosidade e a turbidez. Descompoñen eficazmente os polisacáridos estruturais e adoitan empregarse en combinación con outras encimas, como as celulases e as hemicelulases, para mellorar o rendemento e a claridade. Non obstante, as pectinases non se dirixen especificamente aos compostos fenólicos, que son os principais contribuíntes á turbidez e ao escurecemento oxidativo, especialmente en zumes como os de mazá e uva.⁵⁸Pola contra, as lacasas catalizan a oxidación dos compostos fenólicos, polimerizándoos en moléculas insolubles máis grandes que poden ser eliminadas por sedimentación ou filtración. Este mecanismo non só mellora a claridade, senón que tamén prolonga a vida útil do zume ao reducir a probabilidade de escurecemento oxidativo causado polos compostos fenólicos. Ademais, os procesos de clarificación baseados en lacasas poden levarse a cabo en condicións de procesamento suaves (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40 °C), o que os fai axeitados para zumes delicados sen comprometer as súas propiedades nutricionais ou organolépticas.⁵⁹Os estudos demostraron que o tratamento con pectinase pode clarificar o zume en 1–2 horas, mentres que o tratamento con lacasa normalmente require un tempo de reacción máis longo (de 3 a 6 horas) para reducir completamente os compostos fenólicos. Non obstante, este proceso pódese optimizar inmobilizando o encima ou combinando a lacasa con métodos de clarificación mecánica.⁶⁰Neste estudo, a análise encimática do extracto bruto revelou actividades significativas de lacasa e α-amilase, mentres que as actividades de pectinase e xilanase foron extremadamente baixas e non se detectou actividade de celulase. Polo tanto, a redución da turbidez e do contido fenólico debeuse principalmente á acción da lacasa, mentres que o cambio na viscosidade podería deberse en parte á acción da amilase.
A táboa 1 mostra os parámetros fisicoquímicos do zume de mazá acabado de espremer e das mostras tratadas con lacasa. Os resultados mostraron que o rendemento do zume de mazá acabado de espremer (71,59 %) foi inferior ao das mostras tratadas con lacasa (87,34 %). Estes resultados concordan cos achados de Pilnik e Orange.⁶¹, quen indicou que o uso de encimas no procesamento de froitas pode aumentar o rendemento do zume, mellorar a filtración e obter un zume claro e de alta calidade para a concentración. O aumento do rendemento do zume débese principalmente ao aumento do contido de azucres solubles no zume. Durante a hidrólise encimática das froitas, a mesoglea e a pectina das paredes celulares do produto destrúense e convértense en substancias solubles como azucres e ácidos neutros.^62.O valor do pH do zume de mazá tratado con encimas foi significativamente menor que o do grupo de control (P < 0,05) e o valor do pH de ambos os grupos aumentou significativamente durante o almacenamento (Táboa 1). Estes resultados concordan cos de Mark et al.⁶³, quen observou que o pH do zume de froita de anacardo diminuíu despois do almacenamento tras o tratamento térmico. A degradación da pectina e a formación de ácido galacturónico despois do tratamento encimático poden ser responsables do aumento do pH durante o almacenamento. O pH das mostras tratadas con encimas mantívose entre 4,05 e 4,31 durante todo o almacenamento, mentres que o pH do zume de mazá non tratado oscilou entre 4,12 e 4,33.
A acidez total (AT) tanto das mostras sen tratar como das tratadas con lacasa mostrou unha tendencia decrecente co aumento do tempo de almacenamento (Táboa 1). A diminución da acidez atribuíuse á conversión de ácidos orgánicos en carbohidratos ou a reaccións encimáticas, así como á oxidación durante o almacenamento do zume.⁶⁴A acidez total do zume de mazá de control e das mostras tratadas con encimas foi menor que a doutros zumes (zume de amorodo 0,9 %, zume de ameixa 2,2 %, zume de kumquat 1,0 %, zume de albaricoque 2,4 %, zume de laranxa 0,8 %), pero similar á doutros zumes (por exemplo, zume de pera 0,3 %).⁶²Estas diferenzas no zume de mazá acabado de espremer sen tratar poden deberse a varios factores, como as condicións de cultivo, os factores xenéticos, o nivel de madurez e os métodos de procesamento.⁶⁵A diminución da acidez total do zume de mazá de control e tratado con lacasa é consistente cos resultados presentados por Singh et al.⁶⁶en canto á diminución da acidez total do zume de mazá Jin Nuo despois de 74 días de almacenamento. Por outra banda, Oshmiansky e Wojdylo⁶⁷non atoparon ningún cambio significativo na acidez do zume de mazá ao estudar o efecto dos métodos tradicionais de clarificación.
Os resultados presentados na Táboa 1 indican que o valor de sólidos totais solubles (SST) do zume de mazá tratado con lacasa foi maior que o da mostra sen tratar. Estes resultados concordan cos estudos publicados.^{. 68}Ademais, a Táboa 1 mostra que o valor de TSS do grupo de zume de mazá de control foi de 9,58 no punto de tempo inicial e alcanzou os 11,05 ao final do período de almacenamento. Estes valores son inferiores aos valores de TSS do zume de mazá fresco reportados por Hamid et al.^{. 69}(11,2 e 11,80, respectivamente). O valor de TSS das mostras de zume de mazá tratadas con lacasa aumentou significativamente, comezando desde 11,23 e chegando a 12,93 despois de dúas semanas de almacenamento a 4 °C (Táboa 1). Tamén se observou un aumento similar nos TSS durante o almacenamento en froitas cítricas, limóns e laranxas doces. O aumento dos sólidos totais solubles (TSS) durante o almacenamento pode deberse á hidrólise de polisacáridos (amidón) a monosacáridos (azucres), ao aumento da concentración debido á deshidratación do zume e á degradación da pectina no zume a sólidos solubles. O aumento dos sólidos totais solubles (TSS) probablemente se deba ao aumento dos azucres solubles, que poden formarse pola conversión de pectina ou celulosa en azucres solubles por pectina ou celulase, respectivamente, ou pola hidrólise do amidón a azucres, como informaron Hamed et al.^69.O efecto da lacasa nas propiedades do zume de mazá pódese observar visualmente, xa que o zume de mazá tratado con lacasa presenta unha mellor fluidez e unha menor viscosidade que o zume sen tratar. Esta observación rexístrase na Táboa 1; a viscosidade da mostra tratada con encima foi de 1,87 cP, mentres que a viscosidade da mostra de control foi de 2,95 cP. Esta diminución significativa da viscosidade probablemente se deba á maior capacidade de retención de auga das substancias semellantes á pectina e á formación dunha estrutura de rede cohesiva.
Neste estudo, investigouse o efecto da lacasa no índice de escurecemento (IB) do zume de mazá medindo a absorbancia a 420 nm cun espectrofotómetro. Os resultados móstranse na Táboa 1. Durante o almacenamento, o IB das mostras de zume de mazá, tanto nos grupos tratados como nos non tratados, mostrou unha tendencia gradual ao aumento. O IB reflicte o grao de escurecemento e pode servir como...^{un importante}indicador de reaccións de escurecemento enzimáticas e non enzimáticas. A absorbancia aumentou significativamente durante o almacenamento (P < 0,05). Ao final do almacenamento, o_A420O valor das mostras de zume de mazá nos grupos de control e tratados con encimas aumentou aproximadamente un 217 % e un 121 %, respectivamente (Táboa 1). Os resultados indican que o tratamento encimático pode reducir eficazmente o grao de escurecemento aproximadamente un 56 %. Os resultados de Bezerra et al.^[19] son ​​consistentes cos nosos resultados; Empregaron lacasa-glutaraldehído-fibra de coco para clarificar o zume de mazá, reducindo a súa cor orixinal nun 61 %.
Aínda que os polifenois dos zumes de froitas teñen efectos nutricionais e terapéuticos positivos no corpo humano, tamén poden reaccionar coas proteínas, causando turbidez, sedimentación ou deshidratación do zume, alterando así o sabor e o aroma do produto e reducindo a súa vida útil.⁷¹O obxectivo deste estudo foi reducir de forma segura o contido de compostos fenólicos do zume de mazá empregando lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620. Os resultados presentados na Táboa 1 mostran que o contido total de compostos fenólicos do zume de mazá tratado con lacasa se reduciu significativamente antes do almacenamento a 4 °C. Ademais, o contido total de compostos fenólicos tamén diminuíu durante o almacenamento en ambas as mostras estudadas (Táboa 1). Investigación de Sandri et al.⁷²demostrou que o zume de mazá tratado con encimas pode conservar a súa actividade antioxidante e o seu contido en compostos fenólicos. Non obstante, os resultados dun estudo realizado por Lettera et al.⁷³demostran que o tratamento do zume de laranxa con lacasa fúnxica pode reducir o contido de compostos fenólicos ata nun 45 %.
Demostrouse que os compostos fenólicos teñen propiedades como a eliminación de radicais libres, a redución e a inhibición do osíxeno singlete, a transferencia de átomos de hidróxeno e a doazón de electróns aos radicais libres, o que os converte en potentes antioxidantes.⁷⁴Polo tanto, neste estudo, empregáronse métodos baseados en DPPH e FRAP para avaliar o efecto da lacasa na actividade antioxidante do zume de mazá almacenado nun frigorífico durante 14 días (Táboa 2). Ambos os métodos mostraron un aumento da actividade antioxidante durante o almacenamento, o que pode deberse ao aumento dos compostos fenólicos libres ou á formación de produtos da reacción de Maillard (MRP), sendo probablemente os produtos da reacción de Maillard a causa do aumento da actividade antioxidante.⁷⁵As reaccións de escurecemento non encimáticas (incluíndo a degradación do ácido ascórbico, as reaccións de Maillard e a degradación de azucres catalizada por ácidos) producen pigmentos marróns (melanoidinas). Os produtos intermedios de degradación do ácido ascórbico e os produtos de degradación do azucre (como os compostos carbonílicos) poden reaccionar cos aminoácidos mediante reaccións de Maillard.⁷⁶Aínda que o escurecemento das froitas e verduras durante o almacenamento foi estudado amplamente, a nosa comprensión destas reaccións segue a ser limitada.⁷⁷En comparación co método FRAP, o zume de mazá tratado con lacasa mostrou unha actividade antioxidante significativamente menor mediante o método DPPH (Táboa 2), e a actividade antioxidante de todas as mostras aumentou significativamente co aumento do tempo de almacenamento. Neste estudo empregáronse dous métodos diferentes para determinar a actividade antioxidante porque os seus principios difiren. O método DPPH mide a capacidade de neutralizar os radicais libres, mentres que o método FRAP mide a capacidade de reducir os ións de ferro. Polo tanto, recoméndase usar varios métodos para determinar a actividade antioxidante para comprender mellor a actividade antioxidante das mostras estudadas.⁷⁸
Un dos achados clave deste estudo é que a lacasa NRC 620 de *Pleurotus ostreatus* presenta unha actividade óptima a 70 °C e un pH de 3,0. En comparación con outras lacasas fúnxicas que se usan habitualmente para a clarificación de zumes, como as lacasas *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum*, a *P. ostreatus* NRC 620 presenta unha maior estabilidade térmica e un pH máis ácido. As lacasas de *Trametes versicolor* e *Ganoderma lucidum* adoitan presentar unha actividade óptima no rango de 50-60 °C e a valores de pH entre 3,5 e 5,0. Esta diferenza pode contribuír a unha mellora da eficiencia da clarificación dos zumes, especialmente para os zumes ácidos onde a estabilidade a valores de pH máis baixos é fundamental. A característica única de *P. En comparación con outras lacasas fúnxicas estudadas, a *Pleurotus ostreatus* NRC 620 presenta a capacidade de funcionar eficazmente en condicións máis desafiantes. A súa temperatura de actividade óptima máis elevada suxire vantaxes potenciais en aplicacións industriais, como taxas de reacción máis rápidas e unha contaminación microbiana reducida. O seu pH baixo, que se adapta ben á natureza ácida de moitos zumes, pode ser útil nos procesos de clarificación de zumes. Estes resultados xustifican unha maior exploración para a aplicación a grande escala, o que converte o *Pleurotus ostreatus* NRC 620 nunha alternativa viable ás fontes tradicionais de lacasa fúnxica. En comparación con estudos previos, descubrimos que a temperatura óptima é de 60 °C e o pH óptimo é de 3,0. Despois da reacción a 60 °C durante 80 minutos, a lacasa de *Ganoderma lucidum* retívose⁴⁶% da súa actividade.79 Segundo Kurniawati e Nicelle⁸⁰Os encimas de *Ganoderma lucidum* presentan unha estabilidade de excelente a moderada a 25 °C e valores de pH que oscilan entre 5,0 e 8,0, e estabilidade a pH 6,0 e temperaturas que oscilan entre 10 e 30 °C. Neste estudo, descubrimos que o pH e a temperatura óptimos para a actividade encimática de *Pleurotus ostreatus* foron 3,0 e 70 °C, respectivamente. Tras a incubación a 40 °C e 50 °C durante dúas horas, o encima retivo o 68,33 % e o 59,61 % da súa actividade, respectivamente. Ademais, a lacasa de Pleurotus ostreatus NRC 620 mostrou unha alta actividade nun amplo rango de temperatura de 50 °C a 80 °C, alcanzando case a actividade máxima (69 %–98 %), observándose unha actividade máxima a 70 °C.
En conclusión, a lacasa de cogomelo ostra NRC620, obtida en condicións estáticas, demostrou unha actividade e estabilidade óptimas nun rango de condicións de pH e temperatura, o que demostra unha estabilidade superior en comparación con outras fontes de encimas. A adición de 10 mM de MgSO₄ e CuSO₄ aumentou a actividade encimática aproximadamente nun 21 % e un 35 %, respectivamente. Cando se procesou en zume de mazá, o encima reduciu o pH e a viscosidade, mentres que o contido fenólico diminuíu só lixeiramente durante o almacenamento.
Os resultados confirman o potencial da lacasa na industria alimentaria, especialmente na clarificación de bebidas. Ao descompoñer especificamente os compostos fenólicos, a lacasa non só reduce a turbidez e mellora a claridade, senón que tamén mantén a calidade dos zumes de froitas en condicións de funcionamento suaves. A diferenza dos axentes clarificantes tradicionais como a xelatina, a bentonita e o xel de sílice, a lacasa non xera residuos nin elimina aromas agradables das bebidas, o que a converte nunha opción máis respectuosa co medio ambiente e sostible. Ademais, en comparación con outros encimas e métodos de filtración, a lacasa ofrece unha solución específica e rendible sen comprometer a calidade do produto.
Kyomuhimbo, HD e Brink, HG. Aplicacións e estratexias de inmobilización de lacasas que conteñen cobre; unha revisión. Heliyon 9, e13156 (2023).